本生小课堂：小分子ELISA试剂盒的标曲制作

　　小分子抗原或半抗原因缺乏可用于夹心法的两个或两个以上的不同位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可采用竞争ELISA法模式。检测原理是待测样本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。样本中抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等的ELISA测定多用竞争法。

　　实例讲述

　　呕吐毒素(DON)是其中最重要一种毒素，主要来自镰刀菌属，尤其是禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌。由于它可以引起猪的呕吐，故又名呕吐毒素(vomitoxin，VT)。DON广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品，人畜摄入被DON污染的食物、饲料后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡。HPLC等检测方法前处理步骤繁琐且费用昂贵，ELISA方法具有灵敏度高，特异性强，样品前处理相对简单等特点，可经济、快速地检测大量样品。

　　检测原理

　　自主研发的呕吐毒素(DON)ELISA试剂盒采用间接竞争ELISA方法。首先将呕吐毒素抗原结合到酶标板微孔条上，实验时样品或标准品的呕吐毒素与包被的呕吐毒素抗原竞争生物素标记的抗呕吐毒素单抗上的结合位点，游离的成分被洗去。加入辣根过氧化物酶标记的亲和素，生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，呕吐毒素浓度与OD450值之间呈反比，样本吸光值与其含有的呕吐毒素成负相关。

　　数据分析

　　竞争ELISA法的结果判定有两种方法，粗略判定可用第一种定性分析方法，而定量判定用第二种方法。竞争ELISA法的标曲制作和浓度计算与双抗体夹心法ELISA试剂盒明显不同，具体详细说明如下：

　　定性分析

　　用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.527，样本2的吸光度值为1.225，标准品吸光度值分别是：0ppb为2.044;5 ppb为1.758;15 ppb为1.368;45 ppb为0.783;135 ppb为0.287;405 ppb为0.092。则样本1的浓度范围是45ppb～135 ppb;样本2的浓度范围是15 ppb～45 ppb，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中呕吐毒素的浓度范围。

　　定量分析

　　1、百分吸光率的计算

　　标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即

　　B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

　　B0—0(ppb)标准溶液的平均吸光度值

　　标准曲线的绘制与计算

　　以标准品百分吸光率为纵坐标，以呕吐毒素(ppb)的对数为横坐标，【注意：标准曲线OD值范围需处于0-3之间;标准曲线呈现出直线或类似直线形式，以增加标准曲线函数计算的拟合度，有利于提高样本浓度测量准确性】。本试剂盒中以呕吐毒素(ppb)的半对数为横坐标，是依据标准液浓度分别是：0ppb;5 ppb;15 ppb;45 ppb;135 ppb;405 ppb，5 ppb-405 ppb浓度间呈现出后一浓度为前一浓度的3倍，进行对数计算

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