BUNSEN本生小建议：冷冻管的使用要点

　　【概述】冷冻管的安全使用建议：

　　1.使用低温恒温器储存样品时，严格要求低温恒温器应储存在液氮的气相中或冰箱中!如果将冷冻管保存在液氮中，液氮会以一定概率渗入冷冻管内，复苏时由于液氮气化，管内外压力不平衡，容易造成冷冻管爆裂，具有生物危害性。

　　冷冻管的使用要点

　　冷冻管的安全使用建议：

　　1.使用低温恒温器储存样品时，严格要求低温恒温器应储存在液氮的气相中或冰箱中!如果将冷冻管保存在液氮中，液氮会以一定概率渗入冷冻管内，复苏时由于液氮气化，管内外压力不平衡，容易造成冷冻管爆裂，具有生物危害性。

　　2.操作冷冻管复苏，全程使用安全防护设备。建议穿实验服，戴棉手套，在安全的实验台上操作。如有可能，请佩戴护目镜或防护面罩。请格外小心，因为夏天的室内温度会比冬天高。

　　3.冷冻管厂家认为在冷冻保存细胞的储存过程中，冷冻管的冷冻温度需要均匀。冻结不均匀会导致冰塞的产生，冰塞会压制两侧液体的温度传递，进而产生危险的高压，损坏冷冻管。

　　4.冷冻样本量不应超过冷冻储存管所需的工作体积。

　　冷冻管厂家认为细胞的冷冻保存过程;

　　1.用预热的PBS冲洗细胞。弃去PBS后，加入含有EDTA的胰蛋白酶消化液消化细胞(消化液可以薄薄地覆盖细胞表面，消化液的浓度要根据不同的细胞系进行调整)。

　　2.在37度的消化细胞3-5分钟，不要过度消化。

　　3.一旦细胞从底部分离出来，可以用含血清的培养基停止消化，用吸管轻轻吹气，细胞就可以重新悬浮。

　　4.冷冻管厂家认为离心细胞再悬浮以沉淀细胞，弃去上清液，并用含血清的培养基再悬浮细胞沉淀。

　　5.计数细胞(建议使用纽鲍尔室)。

　　6.离心(500 g，5分钟)细胞再悬浮并丢弃上清液。用适当体积的含血清培养基悬浮细胞。

　　7.将细胞重悬液与冷冻保存液(60%培养基，20%流式细胞仪，20%二甲基亚砜)以1，333，601的比例混合，然后转移到冷冻管中。冷冻试管中的细胞浓度应为15106个细胞/毫升。

　　8.冷冻管厂家认为含有细胞的冷冻管应以1 K/min的冷却速度冷冻。上述要求可通过将冷冻管插入装有异丙醇的冷冻箱室中，并将其放入70的冰箱中来实现。如果冷冻溶液中有其他类型的样品，冷冻管应直接在20、70或液氮的气相中冷冻。为了保证每个样品的冷冻效果均匀，4毫升和5毫升的Cryo.s管需要在20冷冻过夜，然后转移到70或液氮的气体层。

　　9.然后将冷冻储存管转移到液氮罐中。为了避免污染(如支原体)并考虑安全预防措施的要求，建议将Cryo.s冷冻管放置在液氮上方的气体层中，而不是液氮层中。

　　冷冻管厂家认为细胞复苏过程：

　　1.从液氮罐中取出冷冻管后，立即放入37的水浴中解冻，解冻时间约为1-2分钟。解冻时，需要不断摇动冷冻管，使其尽快融化。这一步解冻过程越快越好。

　　2.冷冻管厂家认为将解冻后的细胞悬液转移到15 ml离心管中，需要立即加入一定量的含血清培养基进行混合。

　　3.离心(500 g，5分钟)细胞再悬浮并丢弃上清液。用适当体积的含血清培养基重新悬浮细胞沉淀，然后将其分装到一个或多个细胞培养瓶中。

　　4.请遵循细胞接种的推荐浓度。

　　5.在接下来的12小时内，细胞需要在静止状态下培养。

　　6.冷冻管厂家认为细胞更换可在24-48小时后进行。

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