Elisa实验| 双抗体夹心法ELISA实验操作

　　一、标准品稀释及样品准备

　　样本离心4℃，1000Xg，5min

　　标准品离心4℃，10000Xg，1min

　　1mL稀释液溶解标准品，静置1-2min，取7支空EP管，每管加入500μL标准品&样品稀释液，静置后标准品混匀，将液体离心至底部(800Xg，1min)

　　取同体积标准品原液稀释，涡旋混匀，依次倍比稀释标准品，最后一管为空白

　　二、酶标板拆分

　　可按照实验需求拆装板条，让板条松动并轻推底部，拆下板条防止在备用板框上，剩余板条防至铝箔袋，封口存放。

　　三、标准品及样本点样

　　由低到高浓度，每孔100μL，悬空加入(建议均设置复孔)

　　处理后样品取上清溶液，悬空，每孔100μL，腹膜后标记。提前预热，注意温度，37℃孵育90min。

　　四、生物s化抗体工作液制备

　　取适量生物素化抗体稀释液，加入浓缩液，稀释100倍后，颠倒混匀20次，待用。

　　取出酶标板，勿触摸板条底部，甩尽孔内液体后，拍干。将工作液倒入加样槽，悬空垂直加入，100μL/孔，腹膜后标记，37℃孵育60min。

　　五、1x洗液配制

　　根据需求取双蒸水适量，取25x浓缩洗涤液适量，加入烧杯，磁力搅拌器混匀5-10min。

　　六、浓缩HRP酶结合物工作液制备

　　取适量HRP酶结合物稀释液，加入浓缩液，稀释100倍后，颠倒混匀20次，备用

　　取出酶标板，勿触摸板条底部。轻撕覆膜，避免液体溅出。参数设定：洗涤次数3次、洗板条数12条、洗涤液量350μL/孔、震板5s。拍干液体，更换吸水纸。将工作液倒入加样槽，悬空垂直加入，100μL/孔，腹膜后标记，37℃孵育30min。

　　七、显色

　　平衡取出酶标板勿触摸板条底部，轻撕覆膜，避免液体溅出，参数设定。洗涤次数5从，洗板条数12条，洗涤液量350μL/孔，震板5s。拍干液体，更换吸水纸。

　　将底物溶液倒入加样槽，悬空垂直加入，90μL/孔，腹膜后标记，37℃孵育15-30min。

　　八、终止反应

　　平衡取出酶标板，切勿触摸板条底部，显色后前四孔出现明显蓝色剃度。轻撕覆膜，避免液体溅出。悬空垂直加入，50μL/孔，加入终止液时可看到蓝色立转为黄色。

　　九、数据处理

　　轻轻擦拭板底，放入酶标仪中，上机操作。

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