知识分享：BUNSEN本生冷冻管的使用要点及安全建议

　　冷冻管的使用要点：

　　冷冻管是一种用于低温保存样品的实验管。常用规格有0.5ml、1.8ml、5ml、10ml等。冷冻管使用不当会引起冷冻管爆炸，导致危险物质泄漏，严重时甚至会造成人身伤害。

　　冷冻管也叫菌种保存管。微生物实验室常用的细菌保存方法有牛奶法、甘油法、斜面法等。复杂程度不同，效果也大不相同。目前国内大部分实验室，实验人员自己制作细菌保存管，不仅增加了工作强度，而且由于各种条件的限制，也不能总是令人满意。

　　1、需要在生物安全柜内操作，要保证操作的无菌性，确保菌种不被污染。

　　2.冷冻管内的小瓷珠颜色可能有所不同，并不意味着任何产品都有不同的功能，而是方便用户对细菌进行编码和标记。

　　3.接种前，因下列情况不得使用冷冻管：

　　A.瓶子出现漏液的情况。

　　B.冷冻管内的冻存保护液混浊(表示已被污染)。

　　C.超过有效保质期。

　　4.小瓷珠一旦从冷冻管中取出，不得以任何理由放回冷冻管中。

　　5.丢弃用过或部分用过的冷冻试管时，应注意防止生物危害。

　　冷冻管的使用步骤：

　　1.从细菌的纯培养物中挑选新鲜培养物，制备浊度约为3-4麦克斯韦比的细菌悬液，并接种到菌种储存管中。

　　2.拧紧储存管，来回转动4-5次，使细菌乳化，不晃动。

　　3.将储存管储存在-20-70的冰箱中。

　　1.使用低温恒温器储存样品时，严格要求低温恒温器应储存在液氮的气相中或冰箱中!如果将冷冻管保存在液氮中，液氮会以一定概率渗入冷冻管内，复苏时由于液氮气化，管内外压力不平衡，容易造成冷冻管爆裂，具有生物危害性。

　　2.操作冷冻管复苏，全程使用安全防护设备。建议穿实验服，戴棉手套，在安全的实验台上操作。如有可能，请佩戴护目镜或防护面罩。请格外小心，因为夏天的室内温度会比冬天高。

　　3.冷冻管厂家认为在冷冻保存细胞的储存过程中，冷冻管的冷冻温度需要均匀。冻结不均匀会导致冰塞的产生，冰塞会压制两侧液体的温度传递，进而产生危险的高压，损坏冷冻管。

　　4.冷冻样本量不应超过冷冻储存管所需的工作体积。

　　冷冻管厂家认为细胞的冷冻保存过程;

　　1.用预热的PBS冲洗细胞。弃去PBS后，加入含有EDTA的胰蛋白酶消化液消化细胞(消化液可以薄薄地覆盖细胞表面，消化液的浓度要根据不同的细胞系进行调整)。

　　2.在37度的消化细胞3-5分钟，不要过度消化。

　　3.一旦细胞从底部分离出来，可以用含血清的培养基停止消化，用吸管轻轻吹气，细胞就可以重新悬浮。

　　4.冷冻管厂家认为离心细胞再悬浮以沉淀细胞，弃去上清液，并用含血清的培养基再悬浮细胞沉淀。

　　5.计数细胞(建议使用纽鲍尔室)。

　　6.离心(500 g，5分钟)细胞再悬浮并丢弃上清液。用适当体积的含血清培养基悬浮细胞。

　　7.将细胞重悬液与冷冻保存液(60%培养基，20%流式细胞仪，20%二甲基亚砜)以1，333，601的比例混合，然后转移到冷冻管中。冷冻试管中的细胞浓度应为15106个细胞/毫升。

　　8.冷冻管厂家认为含有细胞的冷冻管应以1 K/min的冷却速度冷冻。上述要求可通过将冷冻管插入装有异丙醇的冷冻箱室中，并将其放入70的冰箱中来实现。如果冷冻溶液中有其他类型的样品，冷冻管应直接在20、70或液氮的气相中冷冻。为了保证每个样品的冷冻效果均匀，4毫升和5毫升的Cryo.s管需要在20冷冻过夜，然后转移到70或液氮的气体层。

　　9.然后将冷冻储存管转移到液氮罐中。为了避免污染(如支原体)并考虑安全预防措施的要求，建议将Cryo.s冷冻管放置在液氮上方的气体层中，而不是液氮层中。

　　冷冻管厂家认为细胞复苏过程：

　　1.从液氮罐中取出冷冻管后，立即放入37的水浴中解冻，解冻时间约为1-2分钟。解冻时，需要不断摇动冷冻管，使其尽快融化。这一步解冻过程越快越好。

　　2.冷冻管厂家认为将解冻后的细胞悬液转移到15 ml离心管中，需要立即加入一定量的含血清培养基进行混合。

　　3.离心(500 g，5分钟)细胞再悬浮并丢弃上清液。用适当体积的含血清培养基重新悬浮细胞沉淀，然后将其分装到一个或多个细胞培养瓶中。

　　4.请遵循细胞接种的推荐浓度。

　　5.在接下来的12小时内，细胞需要在静止状态下培养。

　　6.冷冻管厂家认为细胞更换可在24-48小时后进行。

　　冷冻管 本生一直视质量控制为企业的生命，追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承：遵纪守法，严于律己，宽仁以待，敢于承担的企业精神作为标准，以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场，较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢，是我们的发展目标。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作，共创美好的未来。