ELISA实验：哪些因素会导致ELISA实验的假阳性

　　ELISA法对IgG、IgM都有很好的检测能力，因其灵敏度高，价格低廉，操作方便，结果客观，在实验室广泛应用，但在工作中遇到的zui大的问题是出现假阳性的问题。影响因素除了方法学、试剂盒本身之外,还有标本处理、操作不当等多种因素，双试剂两组结果进行配对t检验，差异(P>0.05)均无统计学意义。

　　多种因素可能会导致ELISA法本底偏高。出现灰值，除了严格操作、做好质控外，对可疑假阳性的标本一定要认真复测。为避免假阳性结果的出现现将产生假阳性的原因分析如下：

　　1、内源性因素

　　(1)年龄因素

　　老年人容易出现免疫功能异常，产生一些异常蛋白质干扰了检测的结果出现假阳性。

　　(2)疾病因素

　　类风湿关节炎、红斑狼疮、糖尿病、自身免疫性疾病等可使患者体内含有嗜异性抗体，自身抗体、类风湿因子等，这些特殊成分在反应过程中有一定的吸附作用，多为体内某些抗原物质干扰所致产生假的显色反应而出现假阳性。

　　2、标本因素

　　(1)标本处理不chedi

　　血液抽出后未wan全凝固而离心分离血清不能使纤维蛋白原wan全析出，加样后板孔中形成纤维蛋白薄膜或絮状物，造成洗板不che底干净，酶残留在反应孔中，使反应孔吸光度值偏高，出现假阳性，待测血清中混有纤维蛋白原，这种物质易沉淀或附着在聚乙烯空内不易洗净，试验表明在较高的离心转速(3000/min)和较长的离心时间(>10/min)之上，血液标本被充分地离心分离后，使红细胞和纤维蛋白充分沉淀，可以在加样时避免加入这两种干扰物质对试验结果的影响。

　　(2)标本溶血

　　标本溶血时细胞内液的各种活性酶以及具有酶活性的物质与底物非特异性结合，洗涤时不易洗去，催化底物产生一定的显色反应，使本底吸光度值偏高形成假阳性。

　　(3)细菌污染

　　标本放置、处置不当被细菌污染，一些细菌体内可能含有内源性辣根过氧化物酶会对相应的酶做标记的测定方法产生非特异性干扰，造成弱的假阳性反应。

　　3、操作因素

　　聚苯乙烯因其具有较长的吸附蛋白质的性能而被广泛用于ELISA试验的固相载体，聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，因此需要通过洗涤清楚在反应过程中，非特异性地吸附于固相载体的干扰物质，洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着试验的成败，可以在加样前离心时得以控制，BUNSEN本生试剂盒 同样也可以通过适当增加洗涤的次数和浸泡时间减轻或避免对试验结果的影响，同样对于血液存在的非特异性的lgG的样本很难在加样时将其去除，那么解决的时机就是洗涤过程。

　　(1)加样太快，加样时加在孔壁上或有气泡。

　　(2)底物液反复使用被污染或被强光照射时间过长。

　　(3)板要平整，尤其是在洗板机洗板的过程中,往往是3排一起洗，如果板不平,就很可能造成洗液有残留，从而导致非特异性结合不能清除干净，对实验结果造成干扰。

　　(4)洗液温度 实验表明:洗液温度也会影响洗板的干净程度，尤其是冬天温度过低时容易出现“花板"问题，因此，需保持在室温在20-30℃。

　　洗液未注满孔，孔壁洗涤不干净也易造成假阳性现象。

　　(5)洗液要新鲜配置，洗液要临用前新鲜配置，放置时间过长易产生絮状物或浑浊，造成赌孔导致假阳性。

　　洗板次数不够或洗涤间隔时间过短也会造成由于洗板不净而造成假阳性，孵育时间过长也会造成假阳性;由于样本较多，加样后未及时放入孵育箱，反应板在室温呆的时间过长，既间接增加了孵育时间，导致孵育时间过长。

　　4、仪器因素

　　(1)酶标仪是垂直对反应孔比色，反应孔底部污染时，出现反应孔吸光度值偏高。

　　(2)洗板拖尾现象，洗板机在洗板过程中，出水针出水不畅，滴滴答答不间断出现水滴，造成板上水过多，拍板不干净。

　　5、方法学因素

　　(1)厂家试剂盒，BUNSEN本生试剂盒 由于不同厂家的诊断试剂所包被的抗原配比以及抗原纯度不尽一致，造成灵敏度和特异性不同，因此也造成了假阳性的产生。三代免疫试剂盒只检测抗体，被某些身体不明抗原干扰，导致的假阳性。

　　(2)实验灰区，在阳性与阴性之间有一条明显的分界线，作为阳性判定值(cutoff)来判定结果，一般把检测值S/COV值在0.6-1范围内时作为灰区带，因此当1

　　(3)“钩状效应"的产生，需对标本进行稀释重复检测。

　　(4)酶标仪的波长选择，建议酶标仪比色时选择双波长，即敏感波长(主波长)和非敏感干扰波长(次波长)，zui后从仪器上得到的读数为敏感波长与非敏感干扰波长之差，排除(板孔的划痕、污迹)干扰。

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