ELISA实验中常见的问题

　　问题一:哪些样本可用于ELISA实验?

　　答:血清、血浆、细胞培养上清、组织匀浆、细胞裂解液、尿液、唾液、脑脊液等。不同的样本类型有不同的处理方法。

　　1、血清:指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白原已被除去的血浆。血清是 ELISA 实验常用的样本，其预处理也十分简单。

　　使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室温下放置 2 小时或 4℃过夜，分离出血清(建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面，使血清可以更大程度地分离出来)。4℃下以1000×g 离心 20 分钟，小心收集上清液(血清)，立即进行测定。建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存，避免反复冻融。

　　在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，这种情况下，ELISA 实验中将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确，出现假阳性结果。另外，样本还应避免细菌污染，因为细菌可能含有内源性HRP，也会导致检测结果不准确。

　　2. 血浆:是离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体。血浆与血清的主要区别在于血浆中含有纤维蛋白。

　　使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后 30 分钟内，4℃下以 1000×g离心 15 分钟，小心收集上清液(血浆)。建议在-20℃或-80℃下将收集的血浆分装保存，避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。常见的抗凝剂包括 EDTA(部分酶相关指标不建议使用)，肝素钠，枸橼酸钠等。检测前请仔细阅读 ELISA 试剂盒说明书，查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。

　　3. 细胞培养上清:含有细胞分泌蛋白和死细胞的细胞培养液。

　　将细胞培养上清液吸入离心管中并以 1000×g 离心 20 分钟，除去细胞碎片和杂质，收集上清液备用，样本保存在-20℃或-80℃，避免反复冻融。

　　4. 细胞裂解液:经细胞裂解液裂解后的细胞溶液。

　　(1)吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。 悬浮细胞可以省略该步骤。

　　(2)将细胞悬浮液收集到离心管中，以 1000×g 离心 10 分钟，然后吸去培养基，用预冷PBS 洗涤细胞 3 次。

　　(3)加入适量的预冷 PBS(建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂)重悬细胞。在 6 孔培养板中，每个孔 需要 150-250μL 的 PBS 来重悬细胞。

　　(4) 使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融，重复冻融过程数次，直至细胞裂解。也可 以使用超声波细胞破碎器超声处理悬浮液来裂解细胞。

　　(5) 4℃下以 10,000×g 离心 10 分钟，去除细胞碎片，收集上清液， -20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

　　5. 组织匀浆

　　(1) 用预冷的 PBS(0.01M，PH7.4)冲洗组织以除去表面残留的血液或杂质。

　　(2) 将组织块称重，然后切成尽可能小的碎块，以便充分匀浆。

　　(3) 加入适量的预冷 PBS(体积取决于组织的重量，9 mL PBS 适用于 1 g 组织，建议使用前立即在 PBS 中加入适量蛋白酶抑制剂)，用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。

　　(4) 将匀浆液吸入离心管中，4℃ 下以 5000×g 离心 5~10 分钟，收集上清液，保存至-20℃或-80℃， 避免反复冻融。

　　一般来说，由于 ELISA 实验只能检测可溶性蛋白质的含量，因此要求样本应清晰透明并离心除去沉淀物或悬浮物质。为确保实验的准确性， -20℃或-80℃保存的样本应在 1-6个月内完成检测，4℃保存的样本在一周内完成检测。

　　问题二:ELISA法一般都能检测血清、血浆和细胞上清吗?

　　答:不能。原因主要从指标适应性和体系适应性2个方面来说明。

　　首先，我们要根据既往的研究和文献报道确认，我们所检测的靶标是否在血清、血浆中有正常表达，是否在疾病状态，特殊生理时期，特定的生物钟时会分泌表达，如果以上几种情况都不存在，或者暂时没有研究结果支持，那么使用血清或血浆检测可能无信号值。另外，ELISA 方法并不是只能检测分泌性靶标，某些靶标经适当的裂解作用后，释放出靶标蛋白的样本同样可以进行检测，目前我们的产品中也有不少此类靶标。再说，细胞上清样本。同样的，需要根据既往的研究和文献报道或者客户的实验设计确认，我们所检测的靶标是否分泌到上清中，如果无研究和文献支持，那么检测可能无信号值。也就是不适合使用上清样本检测。

　　其次，我们使用的血清、血浆、细胞上清样本属于复杂基质的样本，常常混合了其他与靶标蛋白可能发生结合的或者多种非特异性物质造成的对检测靶标蛋白的干扰，也就是基质效应。那么我们的 ELISA 产品要适应这样的情况，则需要使用适当的生产体系和测试体系来解决这样的问题。这就是我们的检测体系从外观看都一样，但是实际成分不一样的原因。当体系不合适时，可能存在严重的基质效应无法消除，从而干扰测试的准确性。也就是为何，有的产品只能检测血清、血浆，有的产品只能检测细胞上清了。

　　问题三:为什么要做预实验?

　　答:通过预实验可以确定样本的大致浓度范围，防止样本浓度过高或者过低得不到较好的结果，同时也可以节约样本和试剂盒。

　　问题四:预实验做过标曲，正式实验还需要做标曲吗?

　　答:需要。原因是避免出现样本全阴性时无阳性对照。

　　问题五:怎么解释样本越稀释浓度值越高?

　　答:一种原因是样本受基质效应的影响。通过剃度稀释可以消除基质的影响，稀释过后的样本浓度会出现先升高再下降的趋势。

　　另一种原因是样本受药物的影响。

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