【本生生物】细胞培养基础知识点

　　细胞培养是细胞和分子生物学中使用的最重要的工具之一，它为研究正常的生理学和生物化学提供了出色的模型系统(例如，代谢研究，衰老)，药物和有毒化合物对细胞的影响以及细胞的影响 诱变和癌变。 它也用于药物筛查和发育，以及生物化合物(例如疫苗，治疗蛋白)的大规模生产。 将细胞培养用于这些应用中的任何一种的主要优点是可以通过使用一批克隆细胞获得的结果的一致性和可重复性。

　　细胞培养是指从动物或植物中去除细胞，然后在有利的人工环境中生长。细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械手段分解，或者它们可以来源于已经建立的细胞系或细胞株

　　1.初级培养

　　原代培养是指细胞从组织中分离并在适当条件下增殖，直到它们占据所有可用基质(即达到汇合)后的培养阶段。在这个阶段，必须通过将细胞转移到具有新鲜生长培养基的新容器中来对细胞进行传代培养(即传代)，以提供更多的继续生长的空间。

　　2.细胞系

　　在第一次继代培养后，原代培养物被称为细胞系或亚克隆。来源于原代培养物的细胞系具有有限的寿命(即，它们是有限的)，当它们传代时，具有最高生长能力的细胞占优势，从而在群体中产生一定程度的基因型和表型一致性。

　　3.细胞株

　　如果通过克隆或其他方法从培养物中积极选择细胞系的亚群，则该细胞系成为细胞株。细胞株通常在亲本系开始后获得额外的遗传变化。

　　4.有限细胞系与连续细胞系

　　正常细胞在失去增殖能力之前通常只分裂有限的次数，这是一种遗传决定的事件，称为衰老;这些细胞系被称为有限的。然而，一些细胞系通过一种称为转化的过程变得不朽，这种过程可以自发发生，也可以通过化学或病毒诱导。当一个有限的细胞系经历转换并获得无限分裂的能力时，它就变成了一个连续的细胞系。

　　连续培养的细胞系容易发生遗传漂变，有限的细胞系注定会衰老，所有细胞培养物都容易受到微生物污染，即使是运行实验室也可能出现设备故障。由于已建立的细胞系是一种宝贵的资源，其替代品昂贵且耗时，因此将其冷冻保存以备长期储存至关重要。

　　一旦从传代培养中获得少量剩余的细胞，应将其作为种子储备冷冻，并加以保护，不得供一般实验室使用。可从冷冻种子储备中制备和补充工作储备。如果种子储备耗尽，然后，冷冻保存的工作储备可以作为制备新鲜种子储备的来源，从初始冷冻开始，产生数量的增加最小。

　　冷冻保存培养细胞的最佳方法是在液氮中，在培养基中，在二甲基亚砜(DMSO)或甘油等冷冻保护剂的存在下保存细胞。低温保护剂可以降低介质的冰点，也可以降低冷却速度，从而大大降低冰晶形成的风险，而冰晶形成会损害细胞并导致细胞死亡。

　　DMSO已知有助于有机分子进入组织。处理含有二甲基亚砜的试剂时，应使用适用于此类材料危害的设备和做法。按照当地法规处理试剂。

　　从冷冻工作细胞储备中培养细胞：

　　确定传代次数，例如，如果先前的细胞被冷冻，它们被解冻三次，解冻过程将是第四次传代。

　　将生长培养基(基本培养基、小牛血清和抗生素)添加到标记有细胞系、传代数和日期的T75烧瓶中

　　将烧瓶水平放置在37℃和5%CO2的CO2培养箱中至少15分钟。这将使介质升温并达到其正常pH值(7.0-7.6)

　　在37摄氏度的水浴中轻轻搅拌，使冷冻小瓶与细胞系解冻。为了降低污染风险，将O形圈和盖子保持在水位以上(2-5分钟)。

　　将小瓶放在生物安全柜(BSL-2)中。为避免污染，打开小瓶前，用70%乙醇擦拭。

　　将冷冻的细胞瓶内容物转移到含有生长培养基的T75烧瓶中。轻轻混合并摇动烧瓶，使细胞均匀分布在烧瓶表面。

　　在37℃、5%CO2的CO2培养箱中培养烧瓶过夜。允许细胞整夜附着

　　改变增长：

　　将烧瓶在37℃、5%CO2下再培养2-4天，并监测直至细胞生长

　　一旦细胞达到约90%的汇合，可以使用T150烧瓶扩增细胞储备

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