标签： 实时 荧光定量PCR realtime PCR  本生生物

所谓实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

原理及材料：

实验材料：细胞样品
试剂、试剂盒：RNA 提取试剂盒 荧光定量 PCR  MixTRIZOL dNTP lf 仿 逆转录酶 MMLV ybc Taq 酶 DEPC 水 ddH2O TE MgCl2 琼脂糖 溴化乙锭 MOPS jiaquan 乙酸钠 EDTA EB 溴酚兰    
仪器、耗材：离心管 离心机 风光光度计 电泳槽 凝胶板 Realtime PCR 仪

实验步骤:

一、 样品 RNA 的抽提

1.  取冻存已裂解的细胞，室温放置 5 分钟使其溶解。

2.  两相分离 每 1 ml 的 TRIZOL 试剂裂解的样品中加入 0.2 ml 的 lf，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体 15 秒后，15 到 30℃孵育 2 到 3 分钟。4℃下 12 000 rpm 离心 15 分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚 lf 相，中间层以及无色水相上层。RNA 全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的 TRIZOL 试剂的 60%。

3.  RNA 沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA 酶的离心管中。加等体积 ybc 混合以沉淀其中的 RNA，混匀后 15 到 30℃孵育 10 分钟后，于 4℃下 12 000 rpm 离心 10 分钟。此时离心前不可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

4.  RNA 清洗 移去上清液，每 1 mlTRIZOL 试剂裂解的样品中加入至少 1 ml 的 75% 乙醇（75% 乙醇用 DEPCH2O 配制），清洗 RNA 沉淀。混匀后，4℃下 7 000 rpm 离心 5 分钟。

5.  RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA 沉淀在室温空气中干燥 5-10 分钟。

6.  溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 时，先加入无 RNA 酶的水 40μl 用枪反复吹打几次，使其溶解，获得的 RNA 溶液保存于 - 80℃待用。

二、 RNA 质量检测

1.  紫外吸收法测定

先用稀释用的 TE 溶液将分光光度计调零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀释（1:100）后，读取其在分光光度计 260nm 和 280nm 处的吸收值，测定 RNA 溶液 浓度和纯度。

（1）浓度测定

A260 下读值为 1 表示 40 μg RNA/ml。样品 RNA 浓度 (μg/ml) 计算公式为：A260 × 稀释倍数 × 40 μg/ml。具体计算如下：
RNA 溶于 40 μl DEPC 水中，取 5 μl，1:100 稀释至 495 μl 的 TE 中，测得 A260 = 0.21
RNA 浓度 = 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取 5 ul 用来测量以后，剩余样品 RNA 为 35 μl，剩余 RNA 总量为：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

（2）纯度检测

RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA 纯度，比值范围 1.8 到 2.1。

2.  变性琼脂糖凝胶电泳测定

（1）制胶

1 g 琼脂糖溶于 72 ml 水中，冷却至 60℃，10 ml 的 10× MOPS 电泳缓冲液和 18 ml 的 37% jq 溶液 (12.3 M)。
10×MOPS 电泳缓冲液
浓度  成分
0.4 M  MOPS，pH 7.0
0.1 M  乙酸钠
0.01 M  EDTA

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入 25 μl 溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的 1×MOPS 电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

（2）准备 RNA 样品

取 3 μgRNA，加 3 倍体积的 jq 上样染液，加 EB 于 jq 上样染液中至终浓度为 10 μg/ml。加热至 70℃孵育 15 分钟使样品变性。

（3）电泳

上样前凝胶须预电泳 5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm 电压下 2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少 2-3 cm。

（4）紫外透射光下观察并拍照

28S 和 18S 核糖体 RNA 的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提 RNA 的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的 RNA（tRNA 和 5S 核糖体 RNA）组成。在 18S 和 28S 核糖体带之间可以看到一片弥散的 EB 染色物质，可能是由 mRNA 和其它异型 RNA 组成。RNA 制备过程中如果出现 DNA 污染，将会在 28S 核糖体 RNA 带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA 的降解表现为核糖体 RNA 带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

三、样品 cDNA 合成

1.  反应体系

序号          反应物           剂量

1          逆转录 buffer       2 μl

2         上游引物              0.2 μl

3         下游引物              0.2 μl

4          dNTP                   0.1 μl
5       逆转录酶 MMLV     0.5 μl
6         DEPC 水              5 μl
7          RNA 模版            2 μl
8           总体积               10 μl

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm 短暂离心。

2.  混合液在加入逆转录酶 MMLV 之前先 70℃干浴 3 分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶 0.5 μl，37℃水浴 60 分钟。

3.  取出后立即 95℃干浴 3 分钟，得到逆转录终溶液即为 cDNA 溶液，保存于 - 80℃待用。

四、 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量 PCR

1.  β-actin 阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为 1011，反应前取 3 μl 按 10 倍稀释（加水 27 μl 并充分混匀）为 1010，依次稀释至 109、108、107、106、105、104，以备用。

2.  反应体系如下：

标准品反应体系

序号           反应物                           剂量
1       SYBR Green 1 染料             10 μl
2       阳性模板上游引物 F              0.5 μl
3      阳性模板下游引物 R              0.5 μl
4                dNTP                            0.5 μl
5                 Taq 酶                           1 μl
6           阳性模板 DNA                    5 μl
7              ddH2O                            32.5 μl
8               总体积                            50 μl

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm 短暂离心。

3.  管家基因反应体系：

序号            反应物                                剂量
1      SYBR Green 1 染料                   10 μl
2      内参照上游引物 F                         0.5 μl
3     内参照下游引物 R                         0.5 μl
4               dNTP                                    0.5 μl
5               Taq 酶                                   1 μl
6      待测样品 cDNA                             5 μl
7              ddH2O                                  32.5 μl
8             总体积                                    50 μl

轻弹管底将溶液混合， 6000 rpm 短暂离心。

3.  制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2 分钟，然后 93℃ 1 分钟，55℃ 2 分钟，共 40 个循环。

五、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的 DNA 模板

1.  针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的 cDNA 模板进行 PCR 反应。

2.  反应体系

序号                     反应物                        剂量
1                     10× PCR 缓冲液            2.5 ul
2                           MgCl2 溶液              1.5 ul
3                           上游引物 F                 0.5 ul
4                           下游引物 R                0.5 ul
5                            dNTP 混合液            3 ul
6                            Taq 聚合酶               1 ul
7                             cDNA                       1 ul
8                    加水至总体积为               25 ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm 短暂离心。

35 个 PCR 循环（94℃1 分钟；55℃1 分钟；72℃1 分钟）； 72?C 延伸 5 分钟。

（3）PCR 产物与 DNA Ladder 在 2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测 PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。

（4）将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释：将 PCR 产物进行 10 倍梯度稀释：设定 PCR 产物浓度为 1×1010，依次稀释至 109、108、107、106、105、104 几个浓度梯度。

六、 待测样品的待测基因实时定量 PCR

1.  所有 cDNA 样品分别配置实时定量 PCR 反应体系。

2.  体系配置如下：

序号             反应物                                剂量
1            SYBR Green 1 染料               10 ul
2                上游引物                               1 ul
3                下游引物                               1 ul
4                  dNTP                                   1 ul
5              Taq 聚合酶                               2 ul
6             待测样品 cDNA                        5 ul
7                   ddH2O                              30 ul
8                   总体积                               50 ul

轻弹管底将溶液混合，6 000 rpm 短暂离心。

（3）将配制好的 PCR 反应溶液置于 Realtime PCR 仪上进行 PCR 扩增反应。反应条件为：93℃ 2 分钟预变性，然后按 93℃ 1 分钟，55℃1 分钟，72℃1 分钟，共 40 做个循环，最后 72℃7 分钟延伸。

七、 实时定量 PCR 使用引物列表

引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应 (即错配)。

八、电泳

各样品的目的基因和管家基因分别进行 Realtime PCR 反应。PCR 产物与 DNA Ladder 在 2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView 染色，检测 PCR 产物是否为单一特异性扩增条带。

注：仅供参考！