大鼠凝血因子Xa(FXa)elisa试剂盒技术原理

　　试验原理：

　　大鼠凝血因子Xa(FXa)是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA).已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

　　内容及其配制

　　自备材料

　　1)蒸馏水。

　　2)加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

　　3)大鼠凝血因子Xa(FXa)ELISA试剂盒振荡器及磁力搅拌器等。

　　安全性

　　1)避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

　　2)实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

　　3)不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

　　操作注意事项

　　1)试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

　　2)实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

　　3)不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

　　4)使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

　　5)使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

　　6)洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

　　7)底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

　　8)加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

　　9)按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

　　样品收集、处理及保存方法

　　1)血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

　　2)血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

　　3)细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

　　4)组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液

　　5)保存------如果样品不立即使用，大鼠凝血因子Xa(FXa)ELISA试剂盒应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

　　试剂的准备:

　　1)标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。

　　2)洗涤缓冲液(50×)的稀释：蒸馏水50倍稀释。

　　操作步骤:

　　1)使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

　　2)根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

　　3)加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

　　4)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

　　5)每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

　　6)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

　　7)每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

　　8)取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

　　9)在450nm波长处测定各孔的OD值。

　　局限:

　　6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。

　　大鼠凝血因子Xa(FXa)ELISA试剂盒性能

　　1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。

　　2. 特异性：不与其它细胞因子反应。

　　3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。

　　结果判断与分析

　　1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

　　2、以吸光度OD值为纵坐标(Y)，相应的待测物质标准品浓度为横坐标(X)，做得相应的曲线，样品的待测物质含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。